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黃曲霉毒素B1 (Ⅰ型)ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書
【概要】
黃曲霉毒素是曲霉菌屬的黃曲霉和寄生曲霉的二次代謝產(chǎn)物,是自然界最危險(xiǎn)的致癌物質(zhì)之一,廣泛存在于谷物、堅(jiān)果、棉籽以及以此為原料生產(chǎn)的各種食品、油料、酒類、飼料中,并能通過(guò)動(dòng)物體產(chǎn)生同樣有害的代謝產(chǎn)物,存在于牛奶及奶制品,肉類甚至人體血液,組織中。
黃曲霉毒素中毒性最強(qiáng)的是黃曲霉毒素B1,是世界衛(wèi)生組織規(guī)定的I類致癌物質(zhì),毒性是砒霜的68倍,其幾乎一直和黃曲霉毒素B2、G1 和 G2共存,是肝癌的三大致病因素之首。世界大部分國(guó)家和地區(qū)都已對(duì)食品和飼料中的黃曲霉毒素最高允許水平作了規(guī)定,因此,準(zhǔn)確測(cè)定食品及飼料中的黃曲霉毒素含量對(duì)于食品安全監(jiān)控具有重要意義。
【適用范圍】
可定性、定量檢測(cè)玉米、大米、麥類、豆類、花生、飼料、食用油等樣本中的黃曲霉毒素B1。
【試驗(yàn)原理】
本試劑盒采用競(jìng)爭(zhēng)ELISA原理,在微孔板上預(yù)包被黃曲霉毒素B1抗原,加入樣本/黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品溶液及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的黃曲霉毒素B1抗體。樣本或標(biāo)準(zhǔn)品溶液中的黃曲霉毒素B1與預(yù)包被在微孔板上的黃曲霉毒素B1抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的黃曲霉毒素B1抗體。未結(jié)合的酶標(biāo)抗體在洗滌時(shí)被除去。再加入TMB顯色液,讀取吸光值。樣本的吸光值與其所含殘留物黃曲霉毒素B1的含量成負(fù)相關(guān)。對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線,即可得出相應(yīng)殘留物黃曲霉毒素B1的含量。
【試劑盒靈敏度】
試劑盒靈敏度:0.1ppb
【交叉反應(yīng)率】
結(jié)構(gòu)類似物 交叉反應(yīng)率
黃曲霉毒素B1 …………………………………………………………… 100%
黃曲霉毒素B2 …………………………………………………………… 15%
黃曲霉毒素G1 …………………………………………………………… 11%
黃曲霉毒素G2 …………………………………………………………… 4%
黃曲霉毒素M1 …………………………………………………………… 0.5%
【試劑盒組成】
1. 96孔板×1塊
2. 標(biāo)準(zhǔn)液×6瓶:(2ml/瓶)
0ppb, 0.1ppb, 0.3ppb, 0.9ppb, 2.7ppb, 8.1ppb
3. 酶標(biāo)物1瓶 …………………………………………… 6ml
4. 顯色液1瓶 …………………………………………… 12ml
5. 終止液1瓶 …………………………………………… 10ml
6. 濃縮洗滌液 (10×)1瓶 …………………………50ml
7. 濃縮樣品稀釋液(10×)1瓶 …………………… 50ml
【需要而未提供的設(shè)備及試劑】
設(shè)備:
┅┅微孔板酶標(biāo)儀450nm/630nm
┅┅振蕩器
┅┅氮吹儀
┅┅粉碎機(jī)
┅┅離心機(jī)
┅┅天平:感量0.01g
┅┅微量移液器:?jiǎn)蔚?20μl~200μl、200μl~1000μl、八道移液器300μl
試劑:
┅┅甲醇(分析純)
┅┅石油醚
┅┅去離子水(或蒸餾水)
┅┅三氯甲烷
┅┅NaCl
【試劑配制】
1. 樣品稀釋液:將濃縮樣品稀釋液用去離子水按1:9體積比進(jìn)行稀釋(1份濃縮樣品稀釋液+9份去離子水)。
2. 洗滌工作液:將濃縮洗滌液用去離子水按1:9體積比進(jìn)行稀釋(1份濃縮洗滌液+9份去離子水)。
3. 谷物稀釋液:將0.9gNaCl用配制完成的樣品稀釋液溶解并定容至100ml。
4. 啤酒稀釋液:取甲醇,用配制完成的樣品稀釋液按1:4體積比進(jìn)行稀釋(1份甲醇+4份樣品稀釋液)。
5. 50%甲醇:取甲醇,用去離子水按1:1體積比進(jìn)行稀釋(1份無(wú)水甲醇+1份去離子水)。
6. 80%甲醇:取甲醇,用去離子水按4:1體積比進(jìn)行稀釋(4份無(wú)水甲醇+1份去離子水)。
【樣本前處理步驟】
一、 谷物(大米、玉米、小米等低脂含量)(稀釋倍數(shù):8)
1. 取1.0g粉碎的樣品與8ml 谷物稀釋液混合均勻;
2. 強(qiáng)力振蕩3min;
3. 5000g離心10min;
4. 取上清液100μl待測(cè) 。
二、 蛋糕(稀釋倍數(shù):10)
1. 取1.0g粉碎的樣品與4ml 50%甲醇混合均勻;
2. 強(qiáng)力振蕩3min;
3. 5000g離心10min;
4. 取400μl下層液體,加入600μl樣品稀釋液進(jìn)行稀釋,充分混勻;
5. 取100μl稀釋后液體待測(cè) 。
三、 花生、奶油蛋糕(稀釋倍數(shù):10)
1. 取1.0g粉碎的樣品與4.0ml石油醚混合均勻;
2. 加入4ml 50%甲醇混合均勻;
3. 強(qiáng)力振蕩3min;
4. 5000g離心10min;
5. 取400μl下層液體,加入600μl樣品稀釋液進(jìn)行稀釋,充分混勻;
6. 取100μl稀釋后液體待測(cè) 。
四、 食用油(稀釋倍數(shù):10)
1. 取1.0g樣品與4.0ml石油醚混合均勻;
2. 加入4ml 50%甲醇混合,振蕩1min;
3. 靜置10min;
4. 取400μl下層液體,加入600μl樣品稀釋液進(jìn)行稀釋,充分混勻;
5. 取100μl稀釋后液體待測(cè) 。
五、 飼料、面粉、湯圓(稀釋倍數(shù):24)
1. 取3.0g粉碎的樣品與9.0ml 80%甲醇混合均勻;
2. 強(qiáng)力振蕩3min;
3. 2000g離心10min;
4. 取上層清液100μl,加入700μl樣品稀釋液,混合均勻;
5. 取100μl稀釋后液體待測(cè)。
六、 啤酒(稀釋倍數(shù):5)
1. 取200μl啤酒樣品(去除CO2),加入800μl啤酒稀釋液;
2. 振蕩3min;
3. 取100μl稀釋后液體待測(cè)。
七、醬油、醋、葡萄酒(稀釋倍數(shù):8)
1. 取0.5ml樣品,加入0.5ml蒸餾水并加入4.0ml三氯甲烷;
2. 混勻振蕩3min,5000g離心10min;
3. 取1.0ml下層液,60℃氮?dú)獯蹈桑?
4. 加入100μl乙腈溶解干燥物,并加入900μl樣品稀釋液,充分混勻;
5. 取100μl稀釋后液體待測(cè)。
【檢測(cè)步驟】
一、 測(cè)定前須知:
1. 使用之前將所有試劑和所需板條回溫(20~25℃)。
2. 使用之后立即將所有試劑及剩余板條放置2~8℃,干燥環(huán)境保存有利于保持試劑穩(wěn)定性。
3. ELISA分析中的再現(xiàn)性,很大程度上取決于洗板的一致性,正確的洗板操作是ELISA操作中的要點(diǎn)。
4. 在所有恒溫孵育過(guò)程中,避免光線照射,用蓋板膜封住微孔板。
二、操作步驟:
1. 將所需試劑及微孔板取出,放置室溫(20~25℃)30min以上,液體試劑使用前均須搖勻。
2. 取出所需數(shù)量的微孔板,將不用的微孔板與干燥劑一起重新真空密封,放置于2~8℃。不可冷凍。
3. 洗滌工作液在使用前也需回溫。
4. 將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)微孔編號(hào),每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行,并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。
5. 加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50μl到對(duì)應(yīng)的微孔中,加入酶標(biāo)物50μl/孔,輕輕振蕩混勻,用蓋板膜蓋板后置室溫避光反應(yīng)15min。
6. 小心揭開(kāi)蓋板膜,用洗滌工作液充分洗滌,300μl/孔,洗板5次,每次間隔30s,用吸水紙拍干。
7. 加入顯色液100μl/孔,輕輕振蕩混勻,用蓋板膜蓋板后置室溫避光反應(yīng)15min。
8. 加終止液50μl/孔,輕輕振蕩混勻,設(shè)酶標(biāo)儀于450nm處讀取每孔OD值。
【結(jié)果判定】
1. 百分吸光率的計(jì)算
標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光度值的平均值(雙孔)除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)(0標(biāo)準(zhǔn))的吸光度值,再乘以100%,即
百分吸光率(%)= B/ B0×100%
B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值
B0—0(ppb)標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值
2. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計(jì)算
以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo),黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品濃度(ppb)的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對(duì)應(yīng)的濃度,乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中黃曲霉毒素B1實(shí)際含量。
【注意事項(xiàng)】
1. 室溫低于20℃或試劑及樣本沒(méi)有恢復(fù)到室溫(20~25℃)會(huì)導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。
2. 在洗板過(guò)程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況,則會(huì)出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性,重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。
3. 每種試劑使用前均需搖勻。
4. 反應(yīng)終止液為0.5M的硫酸,避免接觸皮膚。
5. 不要使用過(guò)了有效期的試劑盒;也不要摻雜使用過(guò)了有效期的試劑盒;不要交換使用不同批號(hào)試劑盒中的試劑。
6. 儲(chǔ)存條件:
試劑盒保存于2~8℃,不能冷凍,將不用的微孔板重新真空密封。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無(wú)色的顯色劑對(duì)光敏感,因此要避光保存。
7. 試劑變質(zhì)的跡象:
顯色試劑有任何顏色表明顯色劑變質(zhì),應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度(450/630nm)值小于0.5(A450nm<0.5)時(shí),表示試劑可能變質(zhì)。
8. 加入顯色液后,一般顯色時(shí)間為15~30min。若顏色較淺,可延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間到35min(或更長(zhǎng)),但不得超過(guò)40min。反之,則減短反應(yīng)時(shí)間。
9. 該試劑盒最佳反應(yīng)溫度為25℃,溫度過(guò)高或過(guò)低將導(dǎo)致檢測(cè)吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。
【樣品最低檢測(cè)限】
谷物 …………………………………………………0.8ppb
蛋糕 ……………………………………………………1ppb
花生、奶油蛋糕 ……………………………………1ppb
食用油 …………………………………………………1ppb
飼料、面粉、湯圓 ………………………………2.4ppb
啤酒 …………………………………………………0.5ppb
醬油、醋……………………………………………0.8ppb
【貯藏條件及保存期】
貯藏條件:保存試劑盒于2~8℃。
保存期:該產(chǎn)品有效期為12個(gè)月。
電話:4006-099-690 郵編:100081 傳真:010-62158706 公司地址:北京市海淀區(qū)學(xué)院南路68號(hào)吉安大廈A座6層